《蔷薇少女序曲》围绕着神秘的人偶世界展开。主角樱田纯是个性格内向的少年，在一次机缘巧合下，他得到了一个神秘的人偶真红。真红并非普通人偶，而是蔷薇少女之一，拥有强大的力量和鲜明的个性。她来到纯的身边，目的是参加一场名为“爱丽丝游戏”的战斗。在这个游戏中，蔷薇少女们需要相互战斗，夺取对方的蔷薇圣母，最终获胜者将成为“爱丽丝”，获得无上的力量。纯在与真红的相处中，逐渐卷入了这场人偶之间的战斗。他和真红结识了其他蔷薇少女，如雏莓、翠星石等，每个少女都有自己独特的性格和背景故事。在战斗与冒险的过程中，纯和真红之间的羁绊不断加深，同时也揭开了蔷薇少女背后隐藏的秘密。