《少女爱上姐姐》讲述了少年宫小路瑞穗的故事。宫小路瑞穗因祖父的遗愿，转入了圣应女学院。为了不破坏学校传统，他只能以女生的身份入学。在学院里，瑞穗结识了许多性格各异的女生。贵族千金花园静马对瑞穗关怀备至，两人关系逐渐亲密。然而，瑞穗要时刻隐藏自己男生的身份，这期间闹出了不少笑话，也引发了一系列的误会。随着时间推移，瑞穗慢慢融入了这个女生世界，也在与大家的相处中，经历了友情的温暖和成长的烦恼，同时还要面对自己对静马逐渐加深的别样情感。