《夜行书生》以朝鲜时代为背景，讲述了女扮男装的少女赵杨仙为了生计四处奔波，偶然间遇到神秘的夜行书生金圣烈。金圣烈是吸血鬼，白天隐藏身份，夜晚才出来活动，他肩负着对抗邪恶吸血鬼势力的使命。杨仙在与圣烈的相处中，逐渐对他产生信任与感情。与此同时，朝鲜国的世子李允也钟情于杨仙，三人陷入复杂的情感纠葛。而邪恶吸血鬼为了实现自己的野心，不断制造阴谋与混乱，圣烈和杨仙等人在守护正义的过程中，历经重重危险与挑战，他们能否战胜邪恶，守护住朝鲜的和平，杨仙又将在圣烈和李允之间做出怎样的情感抉择，都成为剧中的看点。